2 × Taq Platinum PCR Mix

Свръхчиста HotStart термостабилна ДНК полимераза с висока прецизност.

Taq Platinum DNA Polymerase е химически модифицирана HotStart Taq полимераза с 3′-5 ′ екзонуклеазна активност и 5′-3 ′ екзонуклеазна активност. Ензимната активност на Taq Platinum DNA Polymerase се блокира при стайна температура. Неговата активност може да се активира само след нагряване при 94 ° C в продължение на 5-10 минути, като по този начин се избягва неспецифичното усилване, причинено от праймерно неспецифично отгряване или димер на праймер при ниска температура преди първоначалния цикъл на PCR реакция, и значително подобряване на чувствителността и спецификата на PCR реакцията. В допълнение, Taq Platinum DNA Polymerase има много висока точност, която е на второ място след Pfu полимеразата. Скоростта на удължаване на ДНК полимеризацията е по -бърза от Pfu полимеразата и ефективността на амплификацията е по -висока.

Котка Не Размер на опаковката
4992789 5x1ml
4992790 5 × 1 мл

Подробности за продукта

Експериментален пример

ЧЗВ

Етикети на продукти

Определение на дейност

1 единица (U) Taq Platinum DNA Полимеразна активност се определя като количеството ензим, необходимо за включване на 10 nmol дезоксинуклеотиди в неразтворими в киселина вещества при 74 ° C в рамките на 30 минути, като се използва активирана ДНК на спермата на сьомга като шаблон/праймер.

Контрол на качеството

Чистотата чрез SDS-PAGE откриване е повече от 99%; Не се открива активност на екзогенна нуклеаза; Ген с едно копие в човешкия геном може да бъде амплифициран ефективно; Няма значителна промяна в активността, ако се съхранява при стайна температура за една седмица.

Основни технически параметри

Той има 5′-3 ′ екзонуклеазна активност и 3′-5 ′ екзонуклеазна активност, а неговата вярност е до Pfu полимераза. Скоростта на разширение на Taq Platinum Polymerase е по -бърза от Pfu полимеразата и ефективността на усилване е по -висока. PCR продуктите могат да бъдат директно лигирани до тъпия край или клонирани с ТА вектор. Ако е необходимо да се подобри ефективността на клониране, се препоръчва първо да се пречисти и да се добавят 3'-dA надвеси преди клониране в ТА вектор.

Еднотръбен Taq Platinum MasterMix (Национална сертификация за високотехнологични продукти)

■ Taq Platinum MasterMix подобри специфичността и чувствителността на PCR реакцията и може да усили сложни шаблони с високо съдържание на GC, вторична структура и други подобни. Могат да бъдат усилени само 2 копия на целевия шаблон, което гарантира по -точни експериментални резултати.

■ Уникалната формула Taq Platinum MasterMix прави цялата реакционна система много стабилна и активността няма да бъде повлияна от многократно замразяване или размразяване или продължително съхранение при 4 ° C.

■ Стабилният и ефективен предварително приготвен PCR смесен разтвор може да направи операцията бърза и проста, като значително намали трудоемкостта и грешката при вземането на проби. Високопроизводителният PCR подобрител и оптимизатор също са включени в сместа, което намалява изискванията към условията на PCR.

■ Този продукт има системи, съдържащи багрила и без багрила. Продуктите MasterMix, съдържащи багрила, могат да бъдат директно електрофоризирани след PCR, без да се добавя зареждащ буфер.

Приложения

Той може да замени Pfu полимераза за усилване на продукти с висока вярност от сложни шаблони като геноми и е подходящ за приложения като клониране на експресионни гени, специфични за сайта мутации и анализ на полиморфизъм на единичен нуклеотид (SNP) и др.

Предпазни мерки при проектирането на PCR праймери:

Дължината на грунда обикновено е 20-25 mer. Въпреки това, когато се извършва PCR с дълги фрагменти, дължината на праймера трябва да се увеличи до 30-35 mer.

■ Няма допълнително сдвояване между двата праймера, особено за последните 3 бази в 3 ′ края.

■ Съдържанието на GC трябва да бъде 50-60%и да се избягват местни богати GC или AT. За да направите грунд и шаблон стабилно свързване, избягвайте AT богата структура в 3 ′ края.

■ Избягвайте грунд за образуване на вторична структура.

■ Изберете два праймера с Tm температури близо един до друг.

Изчисляване на Tm стойността на праймерите за PCR:

■ Когато грундът е по -малък от 20 mer: Tm = 2 ° C × (A+T)+4 ° C × (G+C).

■ Когато грундът е повече от 20 mer: Tm = 81,5+0,41 × (GC%)-600/L, където L е дължината на грунда.

■ Настройте температурата на отгряване на (Tm-5) ° C.

PCR грунд вход

Подходящата крайна концентрация на праймери може да бъде избрана между 0,1 μM и 1,0 μM. Твърде ниската концентрация на праймера води до нисък добив на амплификационни продукти, докато твърде високата концентрация на праймера е по-склонна към неспецифично амплифициране. Обикновено, когато количеството на матричната ДНК е голямо или сложна матрична ДНК (като ДНК на човешки геном) се използва като матрица, концентрацията на праймера трябва да бъде по -ниска. Когато количеството на матричната ДНК е малко или като матрица се използва проста матрична ДНК (напр. Плазмидна ДНК и т.н.), концентрацията на праймера трябва да бъде по -висока.

Всички продукти могат да бъдат персонализирани за ODM/OEM. За детайли,моля, щракнете върху Персонализирана услуга (ODM/OEM)


  • Предишна:
  • Следващия:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    Experimental ExampleExperimental Example Използвайте геномна ДНК като матрица за амплифициране на 1 kb фрагмент. След PCR реакцията вземете 5 μl за откриване на електрофореза.
    В: Няма ленти за усилване

    Шаблон А-1

    ■ Шаблонът съдържа белтъчни примеси или Taq инхибитори и т.н. —— Почистете ДНК матрицата, отстранете протеиновите примеси или извлечете матричната ДНК с комплекти за пречистване.

    ■ Денатурацията на шаблона не е завършена —— Увеличете подходящо температурата на денатурация и удължете времето за денатурация.

    ■ Разграждане на шаблона —— Подгответе отново шаблона.

    А-2 грунд

    ■ Лошо качество на грундовете-повторно синтезирайте грунда.

    ■ Разграждане на праймера - Аликвотирайте грундовете с висока концентрация в малък обем за консервиране. Избягвайте многократно замразяване и размразяване или дългосрочно криоконсервиране при 4 ° C.

    ■ Неправилен дизайн на грундове (напр. Дължината на грунда не е достатъчна, димер, образуван между грундовете и т.н.)

    А-3 Mg2+концентрация

    ■ Mg2+ концентрацията е твърде ниска —— Правилно увеличете Mg2+ концентрация: Оптимизирайте Mg2+ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg2+ концентрация за всеки шаблон и грунд.

    A-4 Температура на отгряване

    ■ Високата температура на отгряване влияе върху свързването на грунд и шаблон. —— Намалете температурата на отгряване и оптимизирайте състоянието с градиент от 2 ° C.

    A-5 Време за удължаване

    ■ Кратко време за удължаване —— Увеличете времето за удължаване.

    В: Фалшиво положителен

    Феномени: Отрицателните проби също показват лентите на целевата последователност.

    А-1 Замърсяване с PCR

    ■ Кръстосано замърсяване на целевата последователност или продуктите за амплификация - Внимателно да не се пипетира пробата, съдържаща мишена последователност в отрицателната проба, или да се излее от епруветката за центрофуга. Реагентите или оборудването трябва да бъдат автоклавирани, за да се елиминират съществуващите нуклеинови киселини, а наличието на замърсяване трябва да се определи чрез експерименти с отрицателен контрол.

    ■ Замърсяване с реагенти —— Разпределете реактивите в аликвоти и съхранявайте при ниска температура.

    A-2 Primer

    ■ Mg2+ концентрацията е твърде ниска —— Правилно увеличете Mg2+ концентрация: Оптимизирайте Mg2+ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg2+ концентрация за всеки шаблон и грунд.

    ■ Неправилен дизайн на праймера и целевата последователност има хомология с нецелевата последователност. —— Грундове за повторно проектиране.

    В: Неспецифично усилване

    Явления: PCR амплификационните ленти са несъвместими с очаквания размер, голям или малък, или понякога се появяват както специфични амплификационни ленти, така и неспецифични амплификационни ленти.

    Грунд А-1

    ■ Лоша специфичност на грунда

    —— Грунд за повторно проектиране.

    ■ Концентрацията на грунда е твърде висока —— Правилно увеличете температурата на денатурация и удължете времето за денатурация.

    А-2 мг2+ концентрация

    ■ Mg2+ концентрацията е твърде висока —— Правилно намалете концентрацията на Mg2+: Оптимизирайте Mg2+ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg2+ концентрация за всеки шаблон и грунд.

    А-3 Термостабилна полимераза

    ■ Прекомерно количество ензими —— Намалете подходящо количеството ензими на интервали от 0,5 U.

    A-4 Температура на отгряване

    ■ Температурата на отгряване е твърде ниска-—Подходящо увеличете температурата на отгряване или приемете двустепенния метод на отгряване

    А-5 PCR цикли

    ■ Твърде много PCR цикли —— Намалете броя на PCR циклите.

    В: Пъпчиви или размазани ленти

    Грунд А-1—— Лоша специфичност —— Препроектирайте грунда, променете позицията и дължината на грунда, за да подобрите неговата специфичност; или извършете вложен PCR.

    А-2 шаблонна ДНК

    —— Шаблонът не е чист —— Почистете шаблона или извлечете ДНК с комплекти за пречистване.

    А-3 Mg2+ концентрация

    ——Мг2+ Концентрацията е твърде висока - Правилно намалете Mg2+ концентрация: Оптимизирайте Mg2+ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg2+ концентрация за всеки шаблон и грунд.

    A-4 dNTP

    —— Концентрацията на dNTPs е твърде висока —— Намалете подходящо концентрацията на dNTP

    A-5 Температура на отгряване

    —— Твърде ниска температура на отгряване ——Подходящо повишаване на температурата на отгряване

    А-6 цикли

    —— Твърде много цикли ——Оптимизирайте номера на цикъла

    В: Колко матрична ДНК трябва да се добави в 50 μl PCR реакционна система?
    ytry
    В: Как да усилим дългите фрагменти?

    Първата стъпка е да изберете подходящата полимераза. Редовната Taq полимераза не може да се коригира поради липса на 3'-5 'екзонуклеазна активност, а несъответствието значително ще намали ефективността на удължаване на фрагментите. Следователно, обикновената Taq полимераза не може ефективно да усили целевите фрагменти, по -големи от 5 kb. Taq полимераза със специална модификация или друга висококачествена полимераза трябва да бъде избрана, за да се подобри ефективността на удължаване и да се отговори на нуждите от амплификация с дълги фрагменти. В допълнение, усилването на дълги фрагменти също изисква съответно регулиране на дизайна на грунда, времето за денатурация, времето за удължаване, рН на буфера и т.н. Обикновено грундовете с 18-24 bp могат да доведат до по-добър добив. За да се предотврати повреда на шаблона, времето за денатурация при 94 ° C трябва да бъде намалено до 30 секунди или по -малко на цикъл, а времето за повишаване на температурата до 94 ° C преди усилване трябва да бъде по -малко от 1 мин. Нещо повече, настройването на температурата на удължаване на около 68 ° C и проектирането на времето за удължаване според скоростта от 1 kb/min може да осигури ефективно усилване на дълги фрагменти.

    В: Как да подобрим амплификационната вярност на PCR?

    Степента на грешка при PCR амплификация може да бъде намалена чрез използване на различни ДНК полимерази с висока точност. Сред всички открити досега Taq ДНК полимерази, Pfu ензимът има най -ниската грешка и най -високата вярност (виж приложената таблица). В допълнение към подбора на ензими, изследователите могат допълнително да намалят скоростта на PCR мутация чрез оптимизиране на реакционните условия, включително оптимизиране на състава на буфера, концентрацията на термостабилна полимераза и оптимизиране на броя на PCR цикъла.

    Напишете съобщението си тук и ни го изпратете