2 × GC-богат PCR микс

Шаблон А-1

■ Шаблонът съдържа белтъчни примеси или Taq инхибитори и т.н. —— Почистете ДНК матрицата, отстранете протеиновите примеси или извлечете матричната ДНК с комплекти за пречистване.

■ Денатурацията на шаблона не е завършена —— Увеличете подходящо температурата на денатурация и удължете времето за денатурация.

■ Разграждане на шаблона —— Подгответе отново шаблона.

А-2 грунд

■ Лошо качество на грундовете-повторно синтезирайте грунда.

■ Разграждане на праймера - Аликвотирайте грундовете с висока концентрация в малък обем за консервиране. Избягвайте многократно замразяване и размразяване или дългосрочно криоконсервиране при 4 ° C.

■ Неправилен дизайн на грундове (напр. Дължината на грунда не е достатъчна, димер, образуван между грундовете и т.н.)

А-3 Mg²⁺концентрация

■ Mg²⁺ концентрацията е твърде ниска —— Правилно увеличете Mg²⁺ концентрация: Оптимизирайте Mg²⁺ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg²⁺ концентрация за всеки шаблон и грунд.

A-4 Температура на отгряване

■ Високата температура на отгряване влияе върху свързването на грунд и шаблон. —— Намалете температурата на отгряване и оптимизирайте състоянието с градиент от 2 ° C.

A-5 Време за удължаване

■ Кратко време за удължаване —— Увеличете времето за удължаване.

Феномени: Отрицателните проби също показват лентите на целевата последователност.

А-1 Замърсяване с PCR

■ Кръстосано замърсяване на целевата последователност или продуктите за амплификация - Внимателно да не се пипетира пробата, съдържаща мишена последователност в отрицателната проба, или да се излее от епруветката за центрофуга. Реагентите или оборудването трябва да бъдат автоклавирани, за да се елиминират съществуващите нуклеинови киселини, а наличието на замърсяване трябва да се определи чрез експерименти с отрицателен контрол.

■ Замърсяване с реагенти —— Разпределете реактивите в аликвоти и съхранявайте при ниска температура.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ концентрацията е твърде ниска —— Правилно увеличете Mg²⁺ концентрация: Оптимизирайте Mg²⁺ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg²⁺ концентрация за всеки шаблон и грунд.

■ Неправилен дизайн на праймера и целевата последователност има хомология с нецелевата последователност. —— Грундове за повторно проектиране.

Явления: PCR амплификационните ленти са несъвместими с очаквания размер, голям или малък, или понякога се появяват както специфични амплификационни ленти, така и неспецифични амплификационни ленти.

Грунд А-1

■ Лоша специфичност на грунда

—— Грунд за повторно проектиране.

■ Концентрацията на грунда е твърде висока —— Правилно увеличете температурата на денатурация и удължете времето за денатурация.

А-2 мг²⁺ концентрация

■ Mg²⁺ концентрацията е твърде висока —— Правилно намалете концентрацията на Mg2+: Оптимизирайте Mg²⁺ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg²⁺ концентрация за всеки шаблон и грунд.

А-3 Термостабилна полимераза

■ Прекомерно количество ензими —— Намалете подходящо количеството ензими на интервали от 0,5 U.

A-4 Температура на отгряване

■ Температурата на отгряване е твърде ниска-—Подходящо увеличете температурата на отгряване или приемете двустепенния метод на отгряване

А-5 PCR цикли

■ Твърде много PCR цикли —— Намалете броя на PCR циклите.

Грунд А-1—— Лоша специфичност —— Препроектирайте грунда, променете позицията и дължината на грунда, за да подобрите неговата специфичност; или извършете вложен PCR.

А-2 шаблонна ДНК

—— Шаблонът не е чист —— Почистете шаблона или извлечете ДНК с комплекти за пречистване.

А-3 Mg²⁺ концентрация

——Мг²⁺ Концентрацията е твърде висока - Правилно намалете Mg²⁺ концентрация: Оптимизирайте Mg²⁺ концентрация чрез серия от реакции от 1 тМ до 3 тМ с интервал от 0,5 тМ за определяне на оптималния Mg²⁺ концентрация за всеки шаблон и грунд.

A-4 dNTP

—— Концентрацията на dNTPs е твърде висока —— Намалете подходящо концентрацията на dNTP

A-5 Температура на отгряване

—— Твърде ниска температура на отгряване ——Подходящо повишаване на температурата на отгряване

А-6 цикли

—— Твърде много цикли ——Оптимизирайте номера на цикъла

Първата стъпка е да изберете подходящата полимераза. Редовната Taq полимераза не може да се коригира поради липса на 3'-5 'екзонуклеазна активност, а несъответствието значително ще намали ефективността на удължаване на фрагментите. Следователно, обикновената Taq полимераза не може ефективно да усили целевите фрагменти, по -големи от 5 kb. Taq полимераза със специална модификация или друга висококачествена полимераза трябва да бъде избрана, за да се подобри ефективността на удължаване и да се отговори на нуждите от амплификация с дълги фрагменти. В допълнение, усилването на дълги фрагменти също изисква съответно регулиране на дизайна на грунда, времето за денатурация, времето за удължаване, рН на буфера и т.н. Обикновено грундовете с 18-24 bp могат да доведат до по-добър добив. За да се предотврати повреда на шаблона, времето за денатурация при 94 ° C трябва да бъде намалено до 30 секунди или по -малко на цикъл, а времето за повишаване на температурата до 94 ° C преди усилване трябва да бъде по -малко от 1 мин. Нещо повече, настройването на температурата на удължаване на около 68 ° C и проектирането на времето за удължаване според скоростта от 1 kb/min може да осигури ефективно усилване на дълги фрагменти.

Степента на грешка при PCR амплификация може да бъде намалена чрез използване на различни ДНК полимерази с висока точност. Сред всички открити досега Taq ДНК полимерази, Pfu ензимът има най -ниската грешка и най -високата вярност (виж приложената таблица). В допълнение към подбора на ензими, изследователите могат допълнително да намалят скоростта на PCR мутация чрез оптимизиране на реакционните условия, включително оптимизиране на състава на буфера, концентрацията на термостабилна полимераза и оптимизиране на броя на PCR цикъла.